一.直接免疫熒光法測抗原

　　基本原理
　　將熒光素標(biāo)記在相應(yīng)的抗體上，直接與相應(yīng)抗原反應(yīng)。其優(yōu)點是方法簡便、特異性高，非特異性熒光染色少，相對使用標(biāo)記抗體用量偏大。

　　試劑與儀器
　　磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4
　　熒光標(biāo)記的抗體溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS進行稀釋
　　緩沖甘油：分析純無熒光的甘油9份+pH9.20.2M碳酸鹽緩沖液1份配制
　　搪瓷桶三只（內(nèi)有0.01mol/L，pH7.4的PBS1500ml）
　　有蓋搪瓷盒一只（內(nèi)鋪一層浸濕的紗布墊）
　　熒光顯微鏡
　　玻片架
　　濾紙
　　37℃溫箱等。

　　實驗步驟
　　1.滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待檢標(biāo)本片上，10min后棄去，使標(biāo)本保持一定濕度。
　　2.滴加適當(dāng)稀釋的熒光標(biāo)記的抗體溶液，使其*覆蓋標(biāo)本，置于有蓋搪瓷盒內(nèi)，保溫一30min定時間（參考：30min）。
　　3.取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS沖洗后，再按順序過0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3-5min，不時振蕩。
　　4.取出玻片，用濾紙吸去多余水分，但不使標(biāo)本干燥，加一滴緩沖甘油，以蓋玻片覆蓋。
　　5.立即用熒光顯微鏡觀察。觀察標(biāo)本的特異性熒光強度，一般可用“+”表示：（-）無熒光；（±）極弱的可疑熒光；（+）熒光較弱，但清楚可見；（++）熒光明亮；（+++--++++）熒光閃亮。待檢標(biāo)本特異性熒光染色強度達“++”以上，而各種對照顯示為（±）或（-），即可判定為陽性。

　　注意事項
　　1.對熒光標(biāo)記的抗體的稀釋，要保證抗體的蛋白有一定的濃度，一般稀釋在1：20-100之間，要自行摸索*梯度，建立的稀釋比例，抗體濃度過低，會導(dǎo)致產(chǎn)生的熒光過弱，影響結(jié)果的觀察。
　　2.染色的溫度和時間需要根據(jù)各種不同的標(biāo)本及抗原而變化，染色時間可以從10min到數(shù)小時，一般30min已足夠。染色溫度多采用室溫（25℃左右），高于37℃可加強染色效果，但對不耐熱的抗原（如流行性乙型腦炎病毒）可采用0-2℃的低溫，延長染色時間。低溫染色過夜較37℃30min效果好的多。
　　3.為了保證熒光染色的正確性，試驗時需設(shè)置下述對照，以排除某些非特異性熒光染色的干擾。
　?。?）標(biāo)本自發(fā)熒光對照：標(biāo)本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS。
　?。?）特異性對照（抑制試驗）：標(biāo)本加未標(biāo)記的特異性抗體，再加熒光標(biāo)記的特異性抗體。如果標(biāo)本自發(fā)熒光對照和特異性對照呈無熒光或弱熒光，待檢標(biāo)本呈強熒光，則為特異性陽性染色。
　　4.一般標(biāo)本在高壓*燈下照射超過3min，就有熒光減弱現(xiàn)象，經(jīng)熒光染色的標(biāo)本在當(dāng)天觀察，隨著時間的延長，熒光強度會逐漸下降。

　　二.間接免疫熒光法測抗原

　　基本原理
　　染色程序分為兩步，*步，用已知未標(biāo)記的抗體（待檢標(biāo)本）加到已知抗原（待檢標(biāo)本）標(biāo)本上，在濕盒中37℃保溫30min，使抗原抗體充分結(jié)合，然后洗滌，除去未結(jié)合的抗體。
　　第二步，加上熒光標(biāo)記的抗球蛋白抗體或抗IgG、IgM抗體（通常為熒光標(biāo)記的對應(yīng)二抗）。如果*步發(fā)生了抗原抗體反應(yīng)，標(biāo)記的熒光標(biāo)記的二抗就會和已結(jié)合抗原的抗體進一步結(jié)合，從而可鑒定被檢測抗原。

　　試劑與儀器
　　磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4
　　緩沖甘油：分析純無熒光的甘油9份+pH9.20.2M碳酸鹽緩沖液1份配制。
　　熒光標(biāo)記的抗人球蛋白抗體：以0.01mol/L，pH7.4的PBS進行稀釋。
　　搪瓷桶三只（內(nèi)有0.01mol/L，pH7.4的PBS1500ml）
　　有蓋搪瓷盒一只（內(nèi)鋪一層浸濕的紗布墊）
　　熒光顯微鏡
　　玻片架
　　濾紙
　　37℃溫箱等。

　　實驗步驟
　　1.滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于未知抗原標(biāo)本片，10min后棄去，使標(biāo)本片保持一定濕度。
　　2.滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS適當(dāng)稀釋抗體，覆蓋未知抗原標(biāo)本片。將玻片置于有蓋搪瓷盒內(nèi)，37℃保溫30min。
　　3.取出玻片，置于玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS沖洗1-2次，然后按順序過0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸5min，不時振蕩。
　　4.取出玻片，用濾紙吸去多余水分，但不使標(biāo)本干燥，滴加一滴一定稀釋度的熒光標(biāo)記二抗
　　5.將玻片平放在有蓋搪瓷盒內(nèi)，37℃保溫30min。
　　6.重復(fù)操作3。
　　7.取出玻片，用濾紙吸去多余水分，滴加一滴緩沖甘油，再覆以蓋玻片。
　　8.熒光顯微鏡高倍視野下觀察，結(jié)果判定同直接法。
　　注意事項
　　1.熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察，或于4℃保存4h，時間過長，會使熒光減弱。
　　2.每次試驗時，需設(shè)置以下兩種對照：
　?。?）陰性對照：陰性血清+熒光標(biāo)記物（需有使用人員自行建立標(biāo)準(zhǔn)）
　?。?）熒光標(biāo)記物對照：PBS+熒光標(biāo)記物如果標(biāo)本自發(fā)熒光對照和特異性對照呈無熒光或弱熒光，待檢標(biāo)本呈強熒光，則為特異性陽性染色。
　　3.未知抗原標(biāo)本片需在操作的各個步驟中，始終保持濕潤，避免干燥。
　　4.所滴加的抗體或熒光標(biāo)記物，應(yīng)始終保持在未知抗原標(biāo)本片上，避免因放置不平使液體流失，從而造成非特異性熒光染色。