免疫熒光是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素，再用這種熒光抗體(或抗原)作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原(或抗體)。在細(xì)胞或組織中形成的抗原抗體復(fù)合物上含有標(biāo)記的熒光素，熒光素受激發(fā)光的照射，由低能態(tài)進(jìn)入高能態(tài)，而高能態(tài)的電子是不穩(wěn)定的，以輻射光量子的形式釋放能量后，再回到原來的低能態(tài)，這時發(fā)出明亮的熒光(黃綠色或桔紅色)，利用免疫熒光顯微鏡可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)和定位，以及利用定量技術(shù)測定含量。
常用于免疫熒光組織化學(xué)染色的熒光素有：異硫氰酸熒光素、四甲基異硫氰酸羅丹明、四乙基羅丹明、得克薩斯紅、藻紅蛋白、花青類等。此外還有一些新型熒光染料，如量子點(diǎn)。
(1)異硫氰酸熒光素：FITC性質(zhì)穩(wěn)定，易溶于水和乙醇，能與蛋白質(zhì)結(jié)合，是檢測組織細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)zui常用的熒光探針。它還能標(biāo)記抗體，可用于免疫組織化學(xué)單染或多重染色。缺點(diǎn)是在光照下易淬滅，易受自發(fā)熒光影響。zui大激發(fā)光波長為490nm；zui大發(fā)射光波長為525nm，呈現(xiàn)黃綠色熒光。
(2)四甲基異硫氰酸羅丹明：該熒光素能與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)合，比FITC穩(wěn)定性好，在生理?xiàng)l件下對pH值變化不敏感，熒光強(qiáng)度受自發(fā)熒光干擾小。zui大激發(fā)光波長為550nm；zui大發(fā)射光波長為620nm，呈橙紅色熒光，與FITC發(fā)出的黃綠色熒光對比鮮明，常用于免疫熒光組織化學(xué)雙重染色。
(3)四乙基羅丹明(RB200)：能與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)合，不溶于水，易溶于乙醇和丙酮，性質(zhì)穩(wěn)定，可長期保存，廣泛應(yīng)用于雙標(biāo)記示蹤染色。zui大激發(fā)光波長為570nm，zui大發(fā)射光波長為595-600nm，呈橙紅色熒光。
(4)花青類染料：常用的有Cy3、Cy5等，能與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)合。這類染料的熒光特性與傳統(tǒng)熒光素類似，但水溶性和對光穩(wěn)定性較強(qiáng)，熒光量子產(chǎn)率較高，對pH等環(huán)境不敏感。常用于多重染色。Cy3zui大激發(fā)光波長為570nm，zui大發(fā)射光波長為650nm，呈綠色熒光。但是，在綠光光譜波長激發(fā)下，Cy3也可出現(xiàn)紅色熒光。Cy5的zui大激發(fā)光波長為649nm，zui大發(fā)射光波長為680nm，呈紅色熒光。由于Cy5的zui大發(fā)射波長為680nm，很難用裸眼觀察，而且不能使用高壓汞燈作為理想的激發(fā)光源，因此，使用普通熒光顯微鏡時，不推薦使用Cy5。通常觀察Cy5時需使用激光掃描共聚焦顯微鏡。
(5)乙酸甲酯：其本身不發(fā)熒光，但透膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后，在酯酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂袩晒馓匦缘囊宜峒柞?。其激發(fā)光譜有pH依賴性，是使用zui多的細(xì)胞內(nèi)pH熒光指示劑。zui大激發(fā)光波長為505nm，zui大發(fā)射光波長為530nm，呈綠色熒光。
(6)Indo-1：是典型的雙發(fā)射熒光探針。無鈣時在485nm左右有發(fā)射峰，結(jié)合鈣后，則在405nm處有發(fā)射峰，兩者的比值與細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度成線性關(guān)系，將此比值與標(biāo)準(zhǔn)曲線相比即可得出細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度，因此，可利用此探針定量檢測細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度。zui大激發(fā)光波長為330/346nm，zui大發(fā)射光波長為405/485nm，呈紫色(405nm)或青色(485nm)熒光。
(7)量子點(diǎn)：是近年來研制的一種新型熒光染料，又稱半導(dǎo)體納米晶體，是由幾百或幾千個納米級顆粒構(gòu)成的半導(dǎo)體材料，性質(zhì)穩(wěn)定，溶于水，細(xì)胞本身不能合成和組裝。量子點(diǎn)具有熒光時間長、產(chǎn)生多種顏色、檢測方便和應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。當(dāng)某一波長的激發(fā)光對多種大小不同的量子點(diǎn)進(jìn)行照射時，可以同時觀察到多種顏色，因而可同時進(jìn)行多個目標(biāo)的觀察和檢測。量子點(diǎn)可與抗體、鏈霉親和素等多種分子進(jìn)行耦聯(lián)，檢測靶分子的分布和功能。
